次の各種遺伝毒性試験について、試験の概要（試験に用いる細菌、細胞又は動物の種類、試験方法及び原理、S9 mix 添加の必要性の有無など）を、それぞれの試験について 5 行程度で説明せよ。

①　小核試験 (in vivo) 

②　マウスリンフォーマ試験

③　Ames 試験

　解 説　　　　　

回答例

① 小核試験 (in vivo)
マウスやラットなどの哺乳類動物を用い、化学物質の染色体異常誘発性を評価する試験です。薬物を投与した動物の骨髄細胞や末梢血を採取し、分裂時に染色体の一部が取り残されて生じる小核を持つ未熟赤血球の出現頻度を顕微鏡等で測定します。生体の代謝系をそのまま利用するため、S9 mix の添加は不要です。

② マウスリンフォーマ試験
マウスのリンパ腫由来の培養細胞を用い、化学物質による遺伝子突然変異および染色体異常を検出する in vitro 試験です。正常細胞は、培養液中のトリフルオロチミジンを取り込み、正常な DNA 合成ができず増殖しません。TK (チロシンキナーゼ) 遺伝子に変異が起き、トリフルオロチミジンを取り込まなくなる 薬剤耐性を獲得した細胞のみ増殖します。培養細胞は薬物代謝能を欠くため、S9 mix の添加が必要です。

③ Ames 試験
ネズミチフス菌を用い、化学物質の遺伝子突然変異誘発性を迅速に調べる in vitro 試験です。ヒスチジンを作れない栄養要求性細菌に化学物質を作用させ、復帰突然変異を起こしたコロニーの数をカウントして評価します。細菌は哺乳類特有の代謝酵素を持たないため、S9 mix の添加が必要です。

ーーーー
思考過程

小核試験について

・用いるのは 哺乳類細胞
・評価するのは化学物質の「染色体異常誘発性」
・小核とは、比較的小さい細胞核のこと。細胞分裂時に、染色体の一部がうまく分配されずにちょろっと残ると、そこにできる。

マウスリンフォーマ試験

・ほ乳類 (マウス) 培養細胞を用いて化学物質によって誘発される 染色体異常の有無を検出する試験

Ames 試験　頻出なので、大体以下の内容をふわっと覚えている

・Ames 試験で用いるのはネズミチフス菌（Salmonella Typhimurium)
・使用株は、ヒスチジン生合成酵素遺伝子に変異があり、培地にヒスチジン添加しないと増殖しない。突然変異がおきてヒスチジン生合成が可能になる (復帰突然変異) と、培地上にコロニー数が増える。
・化学物質を加えた時のコロニー数変化により、化学物質の遺伝子変異の起こしやすさを評価する試験が Ames 試験

S9 mix 添加の必要性の有無について
In vitro 試験に用いられる細菌やほ乳類培養細胞は、一般にシトクロム P450 (CYP) を代表とする薬物代謝酵素活性を欠いているため、ベンゾ [a] ピレンやアフラトキシン等の代謝物が遺伝毒性を示す化学物質に対して有効で無い。このため、代謝物を含めてその化学物質の遺伝毒性を検索する場合には、肝臓ホモジネートの 9000× g 上清 (S9)  を添加して試験を行う

これらをふまえて文章を組み立てる

調べた所もあるので回答例のうち

① 「骨髄細胞や末梢血を採取」「未熟赤血球の出現頻度を顕微鏡等で測定」は本番では書けない

② 添加する物質や チロシンキナーゼのことがうろ覚えなので、本番は 1 ~ 2 行しか書けない

③ は回答例に近いものを書きたい　です。

参考になれば幸いです！

化学物質の代謝に関する次の記述の Ⓐ ～ Ⓙ に当てはまるものを語群から選び出し、それぞれの番号を記せ。

「生体内に取り込まれた多くの化学物質は主に Ⓐ で代謝され、 Ⓑ を増すことにより、体外に排泄されやすくなる。この代謝反応は第Ⅰ相反応と第Ⅱ相反応に大きく分けられる。

第Ⅰ相反応は化学物質に官能基を導入する反応で、酸化、 Ⓒ 、加水分解から成る。例えばエタノールはアルコール脱水素酵素及び Ⓓ により酸化され、 Ⓔ に代謝される。

第Ⅱ相反応は第Ⅰ相反応により官能基が導入された化学物質に対して、 Ⓑ が高いグルクロン酸や Ⓕ などと結合する Ⓖ 反応である。

シトクロム P450 は多くの化学物質の酸化を触媒する酵素群で、その多くはミクロソーム画分に存在する。一部の化学物質はシトクロム P450 によって反応性の高い代謝物に変換されることがあり、これを Ⓗ という。例えばベンゾ [a] ピレンは主に Ⓘ により Ⓙ 化され、DNA 付加体を形成して発がん性を獲得する。」

＜語群＞
①塩酸、②硫酸、③酢酸、④乳酸、⑤CYP1A1、⑥CYP3A4、⑦脂溶性、⑧水溶性、⑨脾臓、⑩肝臓、⑪アルデヒド脱水素酵素、⑫グルタチオンS‒転移酵素、⑬縮合、⑭抱合、⑮還元、⑯重合、⑰代謝的活性化、⑱脂質過酸化、⑲アルキル、⑳エポキシ

　解 説　　　　　

【化学物質の代謝 の基礎知識】
吸収、分布を経て化学物質は 代謝 を受け、化学的に変化します。代謝の担い手は、酵素です。薬物代謝に関与する、最も重要な酵素がCYP（シトクロムP） 450 です。代謝を受ける理由は『薬物分子を、「水溶性物質 = 極性が高い物質」に変化させて体外へ排出しやすくするため』です。

【第Ⅰ相反応、第Ⅱ相反応 の基礎知識】
代謝は大きく２つの反応に分類されます。第Ⅰ相反応と、第Ⅱ相反応です。第Ⅰ相反応とは、酸化、還元、「加水分解」　などです。第Ⅱ相反応とはグルクロン酸抱合などの、「抱合」反応です。抱合反応　とは「水溶性分子（例）硫酸、グルクロン酸　など）がくっつく反応」という意味です。

【P450 の基礎知識】
シトクロム P450 は、主に肝臓「ミクロソーム」画分に存在します。ミクロソーム中の P450 は、「基質特異性が低く」、異物代謝の多くを担います。P450 は、薬物等により誘導や阻害を受けます。

例えば、フェノバルビタールやフェニトインは P450 を「誘導」します。喫煙も P450 のサブタイプの一種 CYP1A2 等を「誘導」します。一方、GFJ（グレープフルーツジュース）等は P450 のうち 「CYP3A4」 を「阻害」します。

これらの基礎知識をふまえ
本問の演習を通じて補足知識を適宜追加すると良いです。

Ⓐ：⑩　肝臓
Ⓑ：⑧　水溶性

Ⓒ：⑮　還元
Ⓓ：⑪　アルデヒド脱水素酵素
Ⓔ：③　酢酸

Ⓕ：②　硫酸
Ⓖ：⑭　抱合

Ⓗ：⑰　代謝的活性化
Ⓘ：⑤　CYP1A1
Ⓙ：⑳　エポキシ です。

有機リン系殺虫剤に関する次の記述の Ⓐ ～ Ⓙ に当てはまるものを語群から選び出し、それぞれの番号を記せ。

「有機リン系殺虫剤であるマラチオンや Ⓐ は、神経伝達物質 Ⓑ の分解酵素である Ⓒ の活性中心である Ⓓ と結合し、酵素活性を Ⓔ することにより、 Ⓕ 神経系を興奮させ、 Ⓖ 、流涎、痙攣などの症状を引き起こす。

有機リン系殺虫剤中毒の治療には Ⓗ や Ⓘ が用いられる。Ⓘ は Ⓒ を再賦活化することにより効果を発揮するが、時間が経過し、 Ⓙ を起こしたものには無効であるため、早期に投与する必要がある。」

＜語群＞
①2 ‒ PAM、②ジメルカプロール、③チオ硫酸ナトリウム、④アトロピン、⑤セリン水酸基、⑥バリン水酸基、⑦クロルピリホス、⑧アルドリン、⑨副交感、⑩交感、⑪縮瞳、⑫散瞳、⑬脱アルキル化、⑭脱ハロゲン化、⑮活性化、⑯阻害、⑰アセチルコリン、⑱セロトニン、⑲コリンアセチルトランスフェラーゼ、⑳アセチルコリンエステラーゼ

　解 説　　　　　

Ⓐ ですが
語群から ⑦クロルピリホス か ⑧アルドリン と目処がついたのではないでしょうか。アルドリンは、かつて世界中で使用されていた「有機塩素系」殺虫剤です。有機リン系ではないため、Ⓐ は「クロルピリホス」です。

Ⓑ、Ⓒ、Ⓓ、Ⓔ ですが
有機リン系は、神経伝達物質「アセチルコリン」の分解酵素である「アセチルコリンエステラーゼ」の酵素活性を「阻害」します。具体的には、活性中心である「セリン 水酸基」と結合することで阻害します。

活性中心 セリン残基 イメージ
110 回薬剤師国家試験 問 208209 の図　一部より

Ⓕ、Ⓖ ですが
アセチルコリン分解酵素阻害 → アセチルコリン増加 → 「副交感」神経系 興奮 です。副交感神経系が興奮すると「縮瞳」、流涎、痙攣などの症状を引き起こします。

Ⓗ、Ⓘ、Ⓙ ですが
有機リン系の解毒剤は、抗コリン薬である「アトロピン」や、コリンエステラーゼを復活させる 「２－PAM (プラリドキシム)」が用いられます。２－PAM は服毒から 24 時間以内の速やかな投与が必須です。時間が経つと毒物が酵素と不可逆的に結合 (エージング) するため、時間が経つほど 2 – PAM の効果は低下します。※ エージングは、具体的には リン酸基の「脱アルキル化」です。

以上より
Ⓐ：⑦　クロルピリホス

Ⓑ：⑰　アセチルコリン
Ⓒ：⑳　アセチルコリンエステラーゼ
Ⓓ：⑤　セリン水酸基
Ⓔ：⑯　阻害

Ⓕ：⑨　副交感
Ⓖ：⑪　縮瞳

Ⓗ：④　アトロピン
Ⓘ：①　2 ‒ PAM
Ⓙ：⑬　脱アルキル化　です。

毒性の評価に関する記述 ① ～ ⑤ について、妥当なものには ○ を、妥当でないものには × をそれぞれ記せ。

①　構造活性相関は、実験データの数理モデルへのフィッティングにより、統計学的に最もフィットしたモデルにおいて、通常の動物実験で有意な影響を検出できる反応レベルの用量に対する 95 ％ 信頼限界の下限値を算出する手法である。

②　各種毒性試験において、毒性学的に有害・無害にかかわらず影響が全く認められない最大投与量を無毒性量 (NOAEL) という。

③　ヒトが、ある物質を、24 時間又はそれより短い時間経口摂取した場合に、健康に悪影響を示さないと推定される摂取量を急性参照用量 (ARfD) という。

④　単回投与毒性試験の結果に基づき、統計学的に被験物質の 1 回の投与で 50 ％ の実験動物が死亡すると推定される用量を半数致死量 (LD₅₀) といい、化学物質の急性毒性の強さの指標となる。

⑤　残留農薬や食品添加物など意図的に摂取される物質について、一生涯を通して摂取し続けても健康に有害な影響がないと考えられる一日当たりの摂取量を耐容一日摂取量 (TDI) という。

　解 説　　　　　

① ☓
記述は「ベンチマークドース法」についての記述です。

構造活性相関は、化合物の「化学構造」と「生物学的活性 (薬効や毒性など)」の間に成り立つ関係性です。代表例として、カテコラミンの構造活性相関等が知られています。側鎖の置換基を変化させることで、交感神経受容体に対する作用の強さや選択性が劇的に変わります。

② ☓
何の影響もない最大量なので「NOEL：No Observed Effect Level　無影響量」です。「無毒性量」ではありません。

③ ◯
急性参照用量 (ARfD：Acute Reference Dose) についての記述です。

④ ◯
半数致死量 (LD₅₀：Lethal Dose 50) についての記述です。

⑤ ☓
記述は「一日摂取許容量」(ADI：Acceptable Daily Intake) についてです。TDI は、ダイオキシンや重金属など、環境中から「意図せず」混入してしまう物質が対象です。

自然毒に関する記述 ① ～ ⑤ について、妥当なものには ○ を、妥当でないものには × をそれぞれ記せ。

①　渦鞭毛藻類によって産生され、アオブダイなどに蓄積されるパリトキシン様毒は、横紋筋の融解に由来する激しい筋肉痛を引き起こし、重篤な場合には死に至ることもある。

②　ライムギなどの穀物に寄生する麦角 (バッカク) 菌が産生する麦角アルカロイドは、血管収縮作用があり、壊疽、痙攣などの中毒症状を引き起こす。

③　ペニシリウム属のカビが産生するパツリンは、強力な肝発がん物質であり、リンゴ加工品などから検出されることがある。

④　アセタケ属、カヤタケ属などのキノコに含まれるムスカリンは、交感神経興奮作用を示し、嘔吐、下痢、発汗を引き起こす。

⑤　ジギタリスは強心配糖体であるジギトキシンを含み、嘔吐、下痢、不整脈などの中毒症状を引き起こし、重症になると心臓機能が停止して死亡することがある。

　解 説　　　　　

① ◯
パリトキシン様毒についての記述です。

② ◯

麦角アルカロイドについての記述です。

③ ☓
「パツリンは、・・・強力な肝発がん物質」ではありません。パツリンは神経障害を引き起こします。ちなみに、強力な発がん性で知られるカビ毒 (マイコトキシン) の代表例は、コウジカビが産生する アフラトキシンB₁ です。

④ ☓
「ムスカリンは、交感神経興奮作用を示し」が誤りです。ムスカリンは「副交感神経興奮作用」を示します。その他の記述は妥当です。

⑤ ◯
ジギタリスに含まれる 強心配糖体ジギトキシンについての記述です。

化学物質に関する記述 ① ～ ⑤ について、妥当なものには ○ を、妥当でないものには × をそれぞれ記せ。

①　カルバメート系殺虫剤であるパラコートは、生体内で活性酸素が生成され、細胞障害を生じることにより、肺水腫や肺線維症を引き起こし、呼吸困難で死に至ることが多い。

②　不燃性溶剤で洗浄剤として用いられる四塩化炭素は、シトクロムP450 による代謝でフ

リーラジカルが生成され、肝障害を引き起こす。

③　天然に産出する繊維状鉱物であるアスベストは、繊維が極めて細いため、飛散して吸入してしまうおそれがあり、主に急性の神経障害を引き起こす。

④　ポリ塩化ビニル樹脂等の可塑剤として用いられるフタル酸エステル類は、容器包装などから食品中に溶出し、主に嘔吐や下痢などを引き起こす。

⑤　乳幼児用調製粉乳に不正に混入されたメラミンが原因と思われる乳幼児などの肝障害の被害が報告されている。

　解 説　　　　　

① ☓
毒性メカニズムや症状に関する後半の記述 は妥当ですが、パラコートはカルバメート系ではありません。

② ◯
四塩化炭素に関する記述です。

③ ☓
最後の部分が誤りです。アスベストは「急性の神経障害」ではなく「長期間かけて呼吸器障害、具体的には肺がんや中皮腫」を引き起こします。

④ ☓
最後の部分が誤りです。フタル酸エステルは「嘔吐や下痢」を引き起こすわけではありません。内分泌撹乱作用が懸念されています。

⑤ ☓
最後の部分が誤りです。「肝障害」の被害ではなく、乳幼児の「腎結石等の腎障害」が報告されています。

グラム染色の手順及び使用する薬品を記せ。また、その際に異なる色に染色される原理について説明せよ。

　解 説　　　　　

【グラム染色の基礎知識】
細菌はグラム染色によって、グラム陽性菌とグラム陰性菌に分類されます。グラム陽性は青紫色に、グラム陰性は、赤色に染色されます。グラム染色の流れは、以下の通りです。

色の違いは、細胞の外側構造の違いを反映しています。共通構造として、ペプチドグリカンがあります。グラム陰性菌ではこのペプチドグリカン層が薄い代わりに、外膜と呼ばれる膜があります。外膜には、内毒素であるリポ多糖を含みます。ちなみに、細胞質膜と外膜の間はペリプラズムと呼ばれます。

基礎知識をふまえた回答例

1. グラム染色の手順及び使用する薬品
① 染色（前染色）：クリスタルバイオレット溶液を用いて、菌体を青紫色に染色する 。 

② 媒染：ルゴール溶液を作用させ、クリスタルバイオレットとヨウ素の不溶性複合体を形成させる 。

③ 脱色：エタノール（アルコール）で処理し、特定の菌群から複合体を脱色する 。

④ 対比染色（後染色）：サフラニン溶液を用いて、脱色された菌体を赤色に染色する 。  

2. 異なる色に染色される原理
細菌の細胞壁（外側構造）の構造的違いに起因する 。 

グラム陽性菌（青紫色に染色）は、厚いペプチドグリカン層を持つため、脱色剤であるエタノールを通しにくく、①・②で形成された青紫色の複合体が細胞内に保持される 。そのため、最後の対比染色後も青紫色を呈する 。  

グラム陰性菌（赤色に染色）は、ペプチドグリカン層が薄く、その外側に脂質を多く含む外膜を持つ 。エタノール処理によって外膜の脂質が溶解し、ペプチドグリカン層も薄いため、青紫色の複合体が容易に洗い流されて無色になる 。その後、④ のサフラニン溶液によって赤色に染色される 。

以下の問いに答えよ。

①　グラム陽性であり、芽胞を形成する桿菌の学名について、以下の語群から選び出し、記号を記せ。

②　グラム陰性であり、芽胞を形成しない桿菌の学名について、以下の語群から選び出し、記号を記せ。

＜語群＞
ⒶStaphylococcus aureus、ⒷCampylobacter jejuni、ⒸPseudomonas aeruginosa、ⒹBacillus cereus、ⒺListeria monocytogenes

　解 説　　　　　

まず、語群の微生物ですが
Ⓐ Staphylococcus aureus　黄色ブドウ球菌
Ⓑ Campylobacter jejuni　カンピロバクター・ジェジュニ
Ⓒ Pseudomonas aeruginosa　緑膿菌
Ⓓ Bacillus cereus　セレウス菌
Ⓔ Listeria monocytogenes　リステリア・モノサイトゲネス　です。

黄色ブドウ球菌、カンピロバクター、緑膿菌、セレウス菌、リステリアと読み解けることが前提となります。まず、①、② 共に「桿菌」の学名が問われているため、球菌である Ⓐ は、共に該当しません。ちなみにですが、黄色ブドウ球菌はグラム陽性球菌で、芽胞形成しません。

① ですが
Ⓐ を除いた Ⓑ ~ Ⓔ に注目すると、グラム陽性菌は Ⓓ セレウス菌と Ⓔ リステリアです。そして、セレウス菌は芽胞を形成します。一方、リステリアは芽胞を形成しません。従って、① は Ⓓ です。

② ですが
Ⓐ を除いた Ⓑ ~ Ⓔ に注目すると、グラム陰性菌は Ⓑ、Ⓒ です。Ⓓ、Ⓔ はグラム陽性菌なので該当しません。そして、Ⓑ、Ⓒ 共に桿菌で、かつ、芽胞を形成しません。従って、② は Ⓑ、Ⓒ です。

※ カンピロバクターは、らせん状の独特な形態を持つグラム陰性桿菌であることもおさえておくとよいと思われます。

以上より
① Ⓓ
② Ⓑ、Ⓒ　です。

ウイルスに関する次の記述の Ⓐ ～ Ⓙ に当てはまるものを語群から選び出し、それぞれの番号を記せ。

「ウイルスの直径は通常 Ⓐ ～ Ⓑ nm と著しく小さい微生物であり、生きている Ⓒ でしか増殖できない。ウイルスの遺伝情報を担う Ⓓ である核酸を中心にして Ⓔ の Ⓕ で包まれた構造から成る。Ⓕ は Ⓖ と呼ばれる構造単位から構成されている。Ⓓ と Ⓕ を合わせて Ⓗ と呼ぶ。ウイルスによっては、 Ⓗ を包む Ⓘ を保有する。完全な粒子構造をもち、感染性を有するウイルス粒子を Ⓙ という。」

＜語群＞
① 5 、②20、③300、④1000、⑤細胞内、⑥微生物内、⑦ゲノム、⑧プラスミド、⑨タンパク質、⑩ペリプラズム、⑪カプシド、⑫外膜、⑬カプソメア（又はカプソマー）、⑭ヌクレオカプシド、⑮エンベロープ、⑯細胞壁、⑰ビリオン、⑱ファージ

　解 説　　　　　

Ⓐ、Ⓑ ですが
原子 1 個が大体 1 Å = 0.1 nm です。原子数 100 個程度並べると 10 nm なので、流石に 5nm は小さすぎると感じるのではないでしょうか。一方、1000 nm = 1μm：細菌の大きさ まで行くと、ウイルスとしては大きすぎます。ウイルスの直径は通常「20」 ~ 「300」nm です。

Ⓒ ですが
ウイルスは、細胞を持たない極小の粒子です。他の生物の生きている「細胞内」に侵入した時だけ、その細胞の機能を乗っ取って増殖できるという特徴を有します。

Ⓓ、Ⓔ、Ⓕ、Ⓖ、Ⓗ、Ⓘ ですが
ウイルスは、遺伝情報を担う「ゲノム」である核酸を中心に「タンパク質」の殻で覆われています。このタンパク質の殻は「カプシド」と呼ばれます。ゲノムとカプシドを合わせて「ヌクレオカプシド」といいます。カプシドは多数の、同じ構造を持つ小さなタンパク質である「カプソマー」が組み合わさってできています。カプシドの外側に「エンベロープ」と呼ばれる膜で包まれていることもあります。

Ⓙ ですが
完全な粒子構造をもち、感染性を有するウイルス粒子のことを「ビリオン」と呼びます。エンベロープを有するか関係なく、感染能力を持った完全な状態になれば『ビリオン』です。ちなみに、細菌に感染するウイルス全体の総称がファージです。

以上より
Ⓐ：②　20
Ⓑ：③　300

Ⓒ：⑤　細胞内

Ⓓ：⑦　ゲノム
Ⓔ：⑨　タンパク質
Ⓕ：⑪　カプシド
Ⓖ：⑬　カプソメア（又はカプソマー）
Ⓗ：⑭　ヌクレオカプシド
Ⓘ：⑮　エンベロープ

Ⓙ：⑰　ビリオン　です。

図は、TCA 回路の概略である。図の Ⓐ ～ Ⓙ に当てはまるものを語群から選び出し、それぞれの番号を記せ。(一部の物質の記載は、省略している。)

＜語群＞
①アセチル CoA、②オキサロ酢酸、③ギ酸、④クエン酸、⑤酢酸、⑥スクシニル CoA、⑦フマル酸、⑧リンゴ酸、⑨FAD、⑩FADH₂、⑪NAD⁺、⑫NADH + H⁺

　解 説　　　　　

【クエン酸回路　基礎知識】
クエン酸回路では、ピルビン酸がアセチル CoA となって、回路に取り込まれます。回路への取り込みは「オキサロ酢酸 (C4) ＋アセチル CoA → クエン酸 (C6)」です。補酵素として NAD⁺、FAD が用いられ、それぞれ還元されて NADH、FADH₂ が産生されます。

【クエン酸回路　詳細】
クエン酸
→ イソクエン酸
→ α－ケトグルタル酸 (C5) ※脱炭酸、+NADH
→ スクシニルCoA ※脱炭酸、+NADH
→ コハク酸 (C4) ※ +1GTP
→ フマル酸 ※ +FADH₂
→ リンゴ酸　
→ オキサロ酢酸 ※+NADH  　という回路です。

※覚える時はゴロが便利です。有名なゴロ「クエン酸 いそいで けとばし すぐに こわくなり ふまれた りんごを おきざりに」の「こわくなり ふまれた りんごを おきざり」という部分が、個人的に思い出しやすくて好きです。

Ⓐ：①　アセチル CoA
Ⓑ：④　クエン酸

Ⓒ：⑪　NAD⁺
Ⓓ：⑫　NADH + H⁺

Ⓔ：⑥　スクシニル CoA

Ⓕ：⑨　FAD
Ⓖ：⑩　FADH₂

Ⓗ：⑦　フマル酸
Ⓘ：⑧　リンゴ酸
Ⓙ：②　オキサロ酢酸　です。